研究染色体构成的方法多种多样，其中最常用的是基于染色体固定贴片的染色体组型分析技术，结合荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）的方法能够对特异的染色体进行片段缺失、异位以及拷贝数异常的分析。运用流式细胞术也可以对染色体悬液进行研究。流式染色体组型分析，就是一种使用DNA染料对染色体大小、DNA组成进行分析的方法，此方法已经应用于检查人类染色体畸变、基因定位以及染色体文库的建立。

在此，介绍一种荧光原位杂交与流式细胞术联合应用的染色体研究新技术——染色体流式荧光原位杂交（chromosome flow fluorescence in situ hybridization，CFF）。该方法使用荧光标记的肽核苷酸（peptide nucleic acid ，PNA）探针与染色体进行原位杂交，并结合染色体双参数流式分析，为研究染色体上重复序列的拷贝数、分布特点等提供了有力的检测手段。

● 实验原理：

      染色体经FISH法的变性、洗涤处理后与荧光标记的寡聚肽核苷酸（PNA）探针杂交，并以色霉素A3、Hoechst33258染色。荧光PNA探针本身不带电荷，其能以高亲和力与互补的双链DNA结合，后续流式检测中染色体上该荧光探针标记的强度即反应出DNA重复序列的拷贝数。结合染色体上色霉素A3、Hoechst33258的标记信息，也能反映出该DNA重复序列在整个染色体组的分布特征。

● 实验过程：

1、阻滞细胞至分裂中期，制备染色体悬液

       收集细胞前3-4小时，向处于指数生长期的细胞培养物中加入0.1g/ml的秋水仙素，以阻滞细胞的有丝分裂。350g离心5分钟，弃上清，收集的细胞用低渗溶液重悬3-15分钟。室温，将低渗处理的细胞350g离心3分钟，弃上清，用新鲜配制的预冷染色体分离缓冲液（2 mM EDTA，0.5 mM EGTA，15 mM Tris-HCl，80 mM KCl，20 mM NaCl， 0.1% (体积比) 2-mercaptoethanol，0.1% Triton X-100，0.2 mM spermine ，0.5 mM spermidine）重悬，冰浴15分钟（每200，000个细胞约用1ml染色体分离缓冲液）。将细胞悬液剧烈涡旋75秒。

 2、染色体与荧光标记的PNA探针进行原位杂交并染色

       每105-106的染色体用100U/ml的RNA酶T1室温消化20分钟。4℃，350g离心5分钟，弃上清，用预热至80℃的100l杂交液（70% deionized formamide，0.25% blocking reagent，4.1 mM Na2HPO4，0.45 mM citric acid，1 mM MgCl2，10 mM Tris-HCl；pH 7.4）重悬，即变性处理，80℃ 5分钟。用适当浓度Cy5标记的PNA探针与染色体杂交，室温60分钟。用0.5ml的37℃预热杂交液洗涤2次，5分钟/次。以350l染色体分离缓冲液重悬后，用色霉素A3和Hoechst33258，4℃染色过夜。

3、使用流式细胞仪对荧光PNA探针标记的染色体进行分析、分选。

      用BD Influx流式细胞仪进行实验，针对染色体上标记的不同染料，仪器配置如下：DNA染料Hoechst33258：200mW，351.1nm紫外激发，460/50带通滤光片接收；DNA染料色霉素A3：200mW，457.9nm激光激发，470nm长通滤光片接收；探针荧光标记Cy5：125 mW，642 nm激光激发，670/40带通滤光片接收。

● 实验结果：

      1、 经FISH法的变性、洗涤处理后，染色体在色霉素A3、Hoechst33258双参数分析中具备良好的分辨率，证明对FISH法标记后的染色体进行流式分析是可行的，探针的运用增强了染色体分析的序列特异性。
       2、 荧光PNA探针与染色体的杂交具备良好的特异性，在后续的流式检测中能清晰区分特异、非特异标记的染色体。
       3、 在端粒重复序列的研究中，染色体流式FISH技术与传统的定量FISH技术获得的结果具有很好的相关性。
       4、 在染色体卫星DNA的研究中发现，使用染色体流式FISH技术能将传统双参数流式分析中难于分辨的染色体更清晰的区分开来。根据不同遗传背景的染色体上卫星DNA分布不同的特点，染色体流式FISH技术能应用于杂合细胞的染色体分析、分选中。
       5、 运用染色体流式FISH技术，可以分辨来自不同亲本的两条同源染色体，且根据两者的数量关系可检查出染色体数量是否存在异常。

二．内容解析

     文章运用上述染色体流式FISH技术，将18号染色体特异的L1.84卫星序列作为荧光探针与人染色体进行杂交，后续流式检测发现了2个荧光信号不同的群体（Fig. 2b），即来源于不同亲本的两条同源染色体。同时，流式结果显示：上述2个群体的含量呈现出2：1的数量关系（Fig. 2c），表明该样本存在18号染色体三体的畸变。                                
                       

Figure 2   Chromosome and allele-specific analysis of satellite DNA in mouse and human cell lines. (a,b) Bivariate flow karyograms of Hoechst 33258 versus chromomycin A3 (top) and Cy5 versus chromomycin A3 (bottom) fluorescence of C166 mouse chromosomes hybridized with a major satellite PNA probe (5’-Cy5-GACGTGGAATATGGCAAG-3’; a) and of chromosomes from HT1080 human fibrosarcoma cells hybridized with a PNA probe to L1.84 satellite DNA (5’-Cy5-GAGAATTGAACCACCG-3’; b). Chromosome 18 data are shown in red. (c) Cy5 fluorescence intensity histogram of chromosomes shown in b. Above background fluorescence (*), the two peaks correspond to the two chromosome 18 populations (marked ** and ***). Median Cy5 fluorescence and event frequencies are listed. (d) Hybridization of the L1.84 probe on HT1080 metaphase spreads. Copies with dull Cy5 fluorescence (**) and one with brighter fluorescence (***) are marked. Scale bar, 15 μM.

三．方法点评

优势：                    
1、 具备染色体特异性。
      与传统的以细胞为研究单位的流式FISH技术相比，该方法直接以染色体为检测对象，因此能直接反映特定染色体的序列信息，如端粒的长短、拷贝数多寡等，而非全部染色体的均值。
2、 更高的分辨率。
      与传统的色霉素A3、Hoechst33258双参数染色体流式分析技术相比，增加了序列特异的荧光探针，根据荧光信号的强弱能更好的分辨不同的染色体群体。
3、 样本量小。
      该方法直接以染色体为检测对象，与传统的以细胞为研究单位的流式FISH技术相比，只要有效染色体数能够满足统计学需求，就能保证得到准确结果。
4、 高通量，结果更具统计学意义。
      与传统的定量FISH技术相比，流式的分析速度更快，能在短时间内获得更多染色体的信息，更能满足统计学需求。
5、 结合流式分选，方便下游实验。
      在精确分析染色体特异性标志的同时，运用流式分选技术不但能富集纯化出目标染色体群体，还能借助流式的单颗粒分选技术，获得单条目标染色体，是下游测序、建库等实验取材的好方法。

困难：                    
 1、 针对不同细胞和探针序列需摸索实验条件，以获得最优的染色体分辨率，样本处理的难度较大。
 2、 需将标记的荧光信号强度控制在流式细胞仪的线性检测范围内，以便维持荧光强度与靶序列多寡的计量关系。

四．文献欣赏

实验原理：

从肿瘤组织中提取肿瘤细胞的细胞核，经过BDFACSAriaII分选出单个细胞核至96孔板中，经过Sigma-Aldrich GenomexPlex WGA4试剂盒扩增和纯化单个细胞核中的DNA，经过超声降解DNA后，通过Illumina进行DNA测序                    

Figure 1  Schematic of the experimental workflow of SNS. Step numbering corresponds to the Steps of the PROCEDURE. The FACSAria image is courtesy of Becton, Dickinson and Company; reprinted with permission. HiSeq2000 image is courtesy of Illumina.

实验过程：                    
1、用DAPI染肿瘤组织提取的细胞或者肿瘤细胞的细胞核
2、在FACSAriaII上获取染色后样本，进行单个肿瘤细胞分选至96孔板中
3、进行WGA 6小时作用。将96孔板放置在50℃的热循环中1小时进行充分混匀，然后放置在99℃4min后，将96孔板放置冰上快速冷却；而后利用Sigma-Aldrich GenomexPlex WGA4试剂盒扩增和纯化单个细胞核中的DNA
4、超声降解DNA需要30分钟，将WGA的DNA2μg/75μl移入微管中，duty cycle − 10%, intensity − 4, cycles/burst − 200 and time 80 s后转移至PCR管中进行DNA修复；
5、最终通过Illumina进行DNA测序。

       本方法中，应用流式细胞分选技术对单细胞测序是方法的关键环节。有三个关键要素，FACS设置为单细胞分选样品，流通池和喷嘴必须是干净的，液滴断点必须是稳定的，自动细胞分选单元必须完全定位。要做到这一点，应遵循下列步骤：
      1、用FACSRinse执行“flow cell clean”，并允许它浸泡10分钟，然后再用DDH2O执行“flow cell clean”浸泡10分钟。用 FACSClean高速上样清洗进样部分10分钟，随后用DDH20高速运行10分钟。插入喷嘴，打开液流，并使其稳定30分钟。在分选之前，运行DDH2O并且记录数据5分钟，以验证记录的event数目是否为零。
      2、打开分选测试。打开分选，观察分选侧液流。液流应该是紧密、稳定的。因为只有最左边的分选液流用于分选，所以不要忘了关闭其他分选侧液流电压，以检查极左液流情况。使极左液流进入防溅板的中心开口位置。
      3、使用Accudrop确定断点的DropDelay值。液滴的形成和断开，必须是稳定的。分选模式选择“single cell”。
      4、检查ACDU。ACDU并不是为PCR-板设计的。在96孔Falcon组织培养板上放置PCR板。确保涂抹粘接剂的板状密封件的96孔PCR板的表面平滑。确保PCR板是相对平坦的。由于PCR板的孔径远小于那些组织培养板，因此分选的液滴必须精确打在每孔的中心位置。在设置的分选模式下分选100 个Accudrop微球至表面。移开ACDU，查看微球的分选位置是否合适，继续调整ACDU，直到位于正确的位置。
                                           
                       
Figure 2  Flow sorting of single nuclei on the basis of DNA content. (a) Dot plot view of DAPI-stained nuclei. Gate, drawn on the diagonal, excludes cellular debris and doublets and captures single nuclei. The black dots represent cellular debris and doublets, whereas the green and red dots represent diploid and nondiploid fractions from the single-nuclei gate, respectively. The dot plots are drawn with DAPI-H and DAPI-W to allow for enhanced precision in distinguishing subpopulations. (b,c) Examples of histograms drawn from single-nuclei gates illustrating a diploid profile (b) and an aneuploidy profile (c).

      传统的测序方法是aCGH方法，即比较基因组杂交方法。该方法是通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品（病例样品和对照样品）进行共杂交可检测样本基因组相对于对照基因组的DNA拷贝数变化（CNV），常用于肿瘤或遗传性疾病全基因组CNV检测。但是该方法有一巨大缺陷就是分离出的样本中不光只有肿瘤细胞，还包含很多正常细胞无法区分。进而很大程度上影响测序结果。但是SNS方法就可以有效区分肿瘤细胞和正常细胞的细胞核进而通过流式细胞仪进行分选，从而得到单个肿瘤细胞。流式细胞仪分选方法更加快速、高效、简便和准确                        

实验原理：

研究人员首先准备了两个预知类型的乳腺癌症样品，并将细胞核提取出来用DAPI染色，根据DNA含量不同，用流式将单个细胞核分选出来，对100个单个细胞核进行全基因组扩增后分析基因的拷贝数，研究这些单个细胞之间的进化关系。

实验过程：                    
1、 将肿瘤组织粗分，然后从粗分的组织中分离细胞核。
2、 用DAPI对细胞核进行染色，用流式细胞仪进行分析。
3、 根据细胞的倍性，将单个细胞核分选至96孔板中。
4、 对单个细胞核进行全基因组扩增。
5、 对每个细胞核建立76bp单端DNA文库，覆盖6%基因组。
6、 用KS统计对文库中的50000个bins进行基因拷贝数的分析。
7、 根据每个细胞基因拷贝数整体轮廓和染色体断点形式做进化分析。

     在这项研究中，研究人员首先准备了两个预知类型的癌症样品，这两个样品都属于一种原发性侵入乳腺癌：所谓的三阴乳腺癌（triple-negative）类型——这种类型的乳腺癌最具侵袭性。其中一个样品通过之前的分析，确定为多基因组型（polygenomic）：由不同肿瘤细胞类型组成，其拷贝数目，基因组类型，以及变化过程通过传统方法是无法进行检测的；另外一个样品是单基因组型 （monogenomic）：由单个遗传类型细胞组成，不同于前一个样品，这个样品已经转移到了肝脏。  
      研究人员通过SNS分析方法——单细胞核全基因组扩增，以及新一代测序方法，发现第一个乳腺癌样品中，有三种不同类型的肿瘤细胞亚群，每个亚群都由具有高度相似拷贝数目的细胞组成，研究人员认为这很可能代表了肿瘤的三种不同克隆表达；第二个乳腺癌样本只含有一种类型的肿瘤细胞亚群，且原发癌和转移癌都只有这一种肿瘤细胞亚群。这一新型的单细胞测序在其成本降低之后，对于癌症预后及阶段确定很可能具有临床意义。
                               
                               

Figure：Analysis of 100 single cells from a polygenomic breast tumour.                                a, T10 was macrodissected into 12 sectors, and nuclei were isolated from six sectors and flow-sorted by ploidy. FACS profiles show four distributions of ploidy (F1–F4), which were gated to isolate 100 single cells. b, Neighbourjoining tree of integer copy number profiles showing four major branches ofevolution. c, Phylogenetic tree of consensus profiles show the common ancestors and evolutionary distance between subpopulations. Integer copy number profiles from single cells are displayed below, and pie charts indicate the percentage of cells that constitute each subpopulation.                                

                               

Figure：Analysis of 100 single cells from a monogenomic breast tumour and its liver metastasis.                                a, b, Primary breast tumour T16P was macrodissected and 52 nuclei were isolated from three sectors for FACS, showing two distributions of ploidy (F1 and F2). b, Liver metastasis T16M was macrodissected and 48 nuclei were isolated from three sectors for FACS also showing two ploidy distributions (F1 and F2). c, Neighbour-joining tree of combined integer copy number profiles from the primary and metastatictumours. d, Comparison of primary and metastatic aneuploid consensus copy                               number profiles.                              

                             

Figure：Genetically diverse pseudodiploid cells in the diploid fractions of tumours.                                a–d, Haematoxylin and eosin stained tissues sections are shown in the upper panels with normal (N) and tumour (T) cell percentages indicated. Lower rows show bin counts and copy number profiles of single cells isolated fromthe 2N gated ploidy distributions, and the total number of cells analysed is indicated below each column. The columns are: normal breast tissue cells (a); pseudodiploid cells in T10 (b); pseudodiploid cells in T16P (c); and diploidgated nuclei from T16M (d). e, Bin counts and copy number profiles of single cells from the major aneuploid tumour subpopulations.                        

不足：
     目前本方法只能对6%的基因组进行分析，覆盖较小。                                                                

  暂无..                        

实验原理：                            
      20世纪70年代，流式细胞仪检测细胞（FACS）方法的发明彻底的改变了单细胞量化分析技术。在医学和生物学中单细胞的研究得到了广泛的应用。简言之，将细胞悬液包裹在鞘液中，在直线状态下被多个不同波长的激光束照射，通过光学检测器将每个细胞的荧光信号转换成电信号。通常情况下，细胞标记特定的膜蛋白荧光抗体，根据各荧光信号强度，逐个分析细胞，如大小、颗粒度、膜结合蛋白表达等特性。流式细胞仪每小时可以随机处理数以千计的单个细胞，每次同时分析多达18种蛋白标记物。根据膜蛋白表达分离单个细胞进行移植试验，也可以用于细胞亚群种类的纯化。流式细胞仪可以快速分析单个细胞，并能同时检测多种蛋白标记，在膜蛋白表达水平 、单细胞基因表达、移植实验等做出了突出贡献。
单细胞的基因表达：                            
     虽然FACS可以分析单细胞，但更多的还需要分析细胞的基因表达，进而才能全面了解细胞的特异性。 PCR是在20世纪80年代开发的，并已用于检测和扩增目标单细胞DNA，在基因组学、免疫学得到应用。定量反转录 - 聚合酶链反应（RT-PCR）用来确定单细胞基因表达的含量。RT-PCR方法可以用来从一个单细胞检测几十到几百的mRNA或小RNA的目标。此外，微阵列可以用于组合性混合样品检测，一次可执行数千种的PCR反应，从而为高通量检测单细胞基因的表达提供了帮助。
     使用这些技术，可以根据其独特的基因表达谱，详细分析异质组织细胞亚群（图1）。事实上，识别不同种类的细胞基因表达，往往需要进行大量基因、大量细胞的检测。比如，与我们的合作者迈克•克拉克和他的团队，已经使用了微流体多重PCR技术，描述正常组织和肿瘤中的细胞亚群。这种方法是强大的，因为我们可以使用基因进行细胞分类，亚群分析，并同时阐述细胞基本的生物性质、亚群性质。                   

实验过程：                    
 
单细胞定量PCR                    
高通量单细胞基因表达的微流控芯片用以研究组织和肿瘤细胞的结构                    
1、 把组织样本制成单细胞悬液，标记所需的表面抗体。
2、 利用流式细胞仪单细胞分选技术，将单个细胞分选在每个板孔中。
3、 预定靶基因进行反转录、并采用多重PCR扩增。
4、 将扩增的cDNA上被复用微流控芯片（比例尺，1厘米），具有多达96基因特异引物和探针
5、 单细胞定量PCR。
6、 单细胞基因表达数据的统计分析，可用于识别组成组织的细胞亚群。

单细胞RNA-测序：                    
    单细胞的检测常常需要小分子的精确计数。数字PCR是一种通过有限稀释的方法来计算DNA或RNA分子;样品被划分成许多小型的，孤立的区域，这样平均每个区域预期含有一个分子或更少。每个区域做同样的PCR，通过荧光信号检测到存在或不存在的PCR产物。分子的总数，通过计数每个区域的PCR产物来估算。由于其容量的小型化和并行化，微芯片是实现数字PCR的理想选择。

微阵列技术：                    
    在20世纪90年代出现的，可用于检测数以千计的基因表达，但通常需要1-2微克的mRNA，其相当于106〜107个细胞。为了分析单个细胞，从单细胞样品的RNA进行反转录和PCR扩增，或T7扩增（在体外转录）。RNA-序列提供了更高的灵敏度，单细胞样品被处理后可用于全转录组扩增。

单细胞的基因组测序：                    
    单细胞技术日趋成熟，直接从单细胞的基因组分析逐渐成为可能。这种方法，被扩展应用到所有微生物，从了解气候到感染性疾病的治疗，认识基因组的多样性和细菌生态系统的进化已成为必不可少的工具。所有的微生物，我们仅能认识一小部分。因此，单细胞基因组测序方法的发展，对认识微生物的特性有极大地帮助。
    otteson等。取得了部分的解决方案;他们用微流体数字PCR方法，可对单一细菌的基因任意扩增。这表明，基因功能在一些复杂的生态系统上，可以映射生物体特性，利用白蚁肠道作为模型，通过此方法可以识别约十几个新的细菌种类。达莫等，最近拓展了这项工作，他们使用了一种类似的方法，反映病毒感染白蚁肠道细菌的生态环境。

多重置换扩增（MDA）：                    
    期望尝试从单细胞以获得全基因组序列，大多数采用多重置换扩增（MDA）的方案。MDA一直是非常有效的方法，从样品中扩增所有的DNA ，而不需要预知序列信息。早期的报告，实验室培养的单细菌样本用FACS进行分类和全基因组扩增产物部分测序，在一个微流体装置中，未培养的细菌进行分离、扩增、并部分测序。微流体方法可以对细胞的表征进行处理和可用于小规模的临床样本，临床样本包括个人、环境中不同的未知菌种。从此，单细胞的基因组相关实例已经出版，我们期望能够利用单细胞基因组测序的方法，发现更多新的未知细菌的基因组。
   然而，正如对微生物而言，我们已开始看到了，新的一代单细胞人类基因组分析的方法。这方面的一个例子是：我们近期用微流体的方法进行单个人体细胞基因组扩增。在实验中，芯片设计成48个扩增区域，从而使个体染色体从细胞中可随机分散到不同的区域。这些染色体被独立扩增，使用这种方法我们就能够解决困扰人类基因组测序的问题。

二．实验过程

1、 从复杂的微生物生态系统中将细胞混合物抽样引入到芯片中。
2、 单细胞被分别加入区域
3、 进行细胞裂解和全基因组扩增。
4、 基因组MDA反应产生较大量的DNA
 5、 进行基因组DNA测序库的创建在高通量DNA测序仪上进行测序。                        

       1、目前，无论是单细胞微阵列还是单细胞RNA-测序都非常昂贵，数量少的细胞将很难分析。在不久的将来会得到一定程度上缓解，将测序和RT-PCR结合使用：对数量少的细胞进行分析，通过测序以确定候选基因，用RT-PCR方法，后续可以研究更多数量的细胞。

       2、基因完全相同的细胞也会有相当大的表型变异，这种变化也被称为'噪音'，基因表达中的噪声，一直是热门的研究领域，基因完全相同的细胞有一个非常广泛的嘈杂的基因表达值。多用对数正态函数描述分布学统计，这种数学方法描述虽然精确，但非常复杂。所以，分析大量的样品，得出噪音的平均值，基因表达值才确切。                                            

实验过程：                    
1、将切除的正常的结肠组织和结肠癌组织制备成单个细胞悬液
2、对细胞悬液进行荧光单克隆抗体标记
3、通过BD FACSAriaII对细胞进行分析并进行single-cell单个分选，将单个细胞分选到96孔板中
4、1cell/well的细胞进行RNA反转录后，加载到PCR仪上
5、进行real-time PCR后并进行数据分析
    此外，文中对于BD FACSAriaII单个细胞分选精准度进行了确认（文中使用FACSAriaII 进行单个细胞分选的设置为device: 96-well plate; precision: single-cell; nozzle: 130 μm)，具体见下

实验结论：                    
    研究人员利用以上技术逐个地对正常结肠组织和癌组织细胞中的基因表达情况进行了分析，从中鉴别出了47种差异性表达的基因，并基于这些结果鉴别出了不同的结肠癌细胞亚型，并找到了识别这些细胞的新型标记物。
    新研究的重要发现之一就是揭示了肿瘤异质性产生的根源。长久以来科学家们认为肿瘤是在演进的过程中失去了基因组稳定，发生随机变化而生成了不同生物特性细胞亚群。新研究发现结肠癌细胞形成遵循了正常结肠细胞的分化过程。癌细胞形成机制与正常细胞完全相同，只是小部分的细胞类型发生了不正常的扩大或减少。此外，与以往的认为类似，分析结果还显示在肿瘤组织中基因表达上越是接近不成熟细胞的细胞越是呈现恶性特征。相关研究成果发表在《自然—生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。

不足：
必须单个细胞：流式分选必须建立在样本制备为单个细胞的基础上，才能进行下一步的分选